PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ DẠNG VI KHUẨN SINH ACID ACETIC TRONG LÊN MEN HẠT CACAO BẰNG THÙNG GỖ TẠI ĐĂKLĂK

Phan Thanh Bình*1, Nguyễn Thị Thoa1, Nguyễn Thị Mai1, Phạm Văn Thao1, Trần Thị Thắm Hà1, Võ Văn Thắng1, Võ Thị Thuy Dung1, Trần Thị Hoàng Anh1, Nguyễn Thị Hoài Trâm2

1Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên

2 Viện Công nghiệp thực phẩm Hà Nội.

Tác giả liên hệ: Phan Thanh Bình, ĐT:05003 862 845, email: binhanphuochanh@gmail.com

TÓM TẮT

Vi khuẩn sinh acid acetic (VA) có vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình lên men hạt cacao. Chúng tham gia vào quá trình oxy hóa rượu ê ty líc, được tạo ra bởi hoạt động của nấm men, để tạo thành acid acetic. Trong quá trình lên men hạt cacao Acid acetic kết hợp với nhiệt độ cao được tạo thành do các phản ứng chuyển hóa các hợp chất sinh học sẽ làm chết mầm hạt và phá vỡ các cấu trúc của tế bào để các hợp chất hóa học tác dụng với nhau làm chuyển hóa màu sắc và chất lượng của hạt cacao cuối cùng. Quá trình lên men hạt cacao là quá trình đầu tiên và quan trọng nhất để hình thành nên các hợp chất tiền hương vị, màu sắc và cấu trúc đặc trưng của hạt cacao trong chế biến sô cô la. Phân lập và xác định một số loài VA trong quá trình lên men hạt cacao là bước đầu tạo cơ sở cho việc nhận định cơ chế của quá trình tạo nên hương, vị sô cô la, là cơ sở để nghiên cứu và xây dựng các quy trình lên men nhằm nâng cao và ổn định chất lượng hạt cacao cuối cùng. Phương pháp định danh được sử dụng trong nghiên cứu này là phương pháp kết hợp định danh bằng đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA của một số dạng vi khuẩn đã được phân lập. Kết quả thí nghiệm cho thấy số lượng tế bào VA biến thiên từ 0.0018 x 107 đến 7.2 x 107. Đã phân lập được 7 dạng khuẩn lạc có hình thái khác nhau và định danh chúng thuộc 3 loài, bao gồm: Acetobacter tropicalis, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter indonesiensis.

Từ khóa: Acetobacter, cacao, cơm nhầy, lên men, cơm nhầy

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cacao là một trong những nguyên liệu cần phải trải qua quá trình lên men để chuyển hóa các hợp chất sinh hóa nhờ vi sinh vật (hoặc enzyme), tạo nên tiền hương vị, màu sắc, cấu trúc của hạt cacao dùng làm nguyên liệu chế biến sô cô la (Thompson et al, 2001). Có 4 nhóm vi sinh vật chính tham gia vào quá trình lên men hạt cacao là nấm men, vi khuẩn sinh acid lactic, vi khuẩn sinh acid acetic và Bacillus (Made M. Ardhana, Graham H. Fleet 2003). Nấm men và vi khuẩn sinh acid lactic chiếm ưu thế trong giai đoạn đầu của quá trình lên men (từ 0 – 48h), nấm men tham gia vào quá trình chuyển hóa đường trong lớp cơm nhầy thành rượu ê ty líc và quá trình phân cắt các pectine làm cho lớp cơm nhầy tan ra. Khi lớp cơm nhầy giảm dần, môi trường trong khối hạt thông thoáng hơn tạo điều kiện cho sự hoạt động của VA. VA sẽ sử dụng rượu ê ty líc tạo thành từ hoạt động của nấm men để tạo thành acid acetic đồng thời tỏa nhiệt cao. Tác động của acid acetic và nhiệt độ cao là nguyên nhân làm chết phôi mầm của hạt và tạo ra hàng loạt các phản ứng sinh hóa bên trong hạt, làm thay đổi màu sắc và các chất tiền hương vị trong cacao (Cleenwerck et al, 2007). Một số nghiên cứu của các tác giả trước đã công bố là Acetobacter pasteuriansis là một loài VA tự phát chính tham gia vào trong quá trình lên men hạt cacao, chúng có khả năng thích nghi với acid và nhiệt độ cao mà chúng tạo thành, đồng thời chúng cũng có khả năng chiếm ưu thế khi trong khối ủ có chứa acid lactic và manitol (Camu et al, 2008). Một số nghiên cứu khác cũng đã kết luận là có thể bổ sung một số loài VA đã được kiểm tra bằng các biện pháp sinh hóa, để tham gia vào  trong quá trình lên men (Lagunes et al, 2007). Sự đa dạng của các loài nấm men trong quá trình lên men hạt cacao tại nhiều vùng trên thế giới đã được xác định, tuy nhiên chỉ có một số loài có liên quan trực tiếp đến sự chuyển hóa các chất trong quá trình lên men hạt cacao (Camu et al, 2008). Nielsen và cộng sự nghiên cứu vi sinh vật trong lên men ủ đống và trong khay ở Ghana cho thấy các loài vi khuẩn sản sinh a xít a xê tíc có mật độ cao như: Acetobacter syzygii, Acetobacter pasteurianus and Acetobacter tropicalis được xác định là hiện diện trong suốt quá trình lên men. Một số loài được xác định có sự hiện diện với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình lên men là Bacillus licheniformis Bacillus spp. Mật độ vi khuẩn sản sinh a xít a xê tíc log cfu/g từ 3,7 đến 7,13(D.S. Nielsen 2007). Made M. Ardhana và cộng sự đã phân lập và xác định các vi khuẩn trong lên men hạt cacao tại Indonesia với kết quả: Đối với vi khuẩn sản sinh a xít a xê tíc cả 2 loài Acetobater pasteurianusAcetobater aceti đều thấy xuất hiện sau 24 giờ và có mật độ cực đại từ 105 – 106cfu/g, loài Acetobater pasteurianus phát triển trong suốt quá trình lên men, chịu được nhiệt độ cao, độ cồn trên 10%. Loài Acetobater aceti chỉ sống sót ở độ cồn 5-7%. 2 loài này không thấy có liên quan tới các enzyme cellulase, amylase, protease, lipase(Made M. Ardhana 2003). Tại Ecuado Zoi Papalexandratou đã phân lập được nhiều loài vi khuẩn trong đó có loài Acetobacter pasteurianus là loài hiện diện chính trong quá trình chuyển hóa rượu thành a xít a xê tíc ở giai đoạn sau (Zoi Papalexandratou, 2011). Nghiên cứu tại Cộng hòa Dominic với 44 dạng được phân lập có Lactobacillus pentosus (6 dạng), Lactobacillus plantarum hoặc Lactobacillus paraplantarum (24 dạng), Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (10 dạng) và Lactobacillus brevis (4 dạng). Tất cả các dạng này đều có khả năng tạo a xít lắc tíc, a xít a xê tíc, rượu và CO2(Sandra Lagunes Gálvez, 2007). Trong quá trình lên men hạt cacao các loại vi khuẩn đã được chọn lựa với những ưu điểm: Lactobacillus fermentum được chọn lựa cho quá trình phân hủy a xít citric, tạo a xít lắc tíc, chống chịu độ rượu cao, chịu nhiệt, chịu a xít lắc tíc; Acetobater tropicalis ô xy hóa rượu và a xít lắc tíc, chịu nhiệt, a xít, a xít a xê tíc, rượu (Gilberto Vinícius de Melo Pereira, 2012)

Tại mỗi vùng, mỗi quốc gia khác nhau thì hệ vi sinh vật tự phát cũng khác nhau, trong nghiên cứu này chúng tôi đã phân lập và xác định bằng biện pháp sinh học phân tử một số loài VA chính, tham gia vào quá trình lên men hạt cacao tại Đaklak để làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về qui trình lên men hạt cacao tại Việt Nam.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Hạt cacao thuộc giống Forastero Trinitario được lấy từ công ty Trách nhiệm hữu hạn Tư vấn Đầu tư Phát triển Nông Lâm nghiệp Eakmat, Buôn Mê Thuột, Đaklak, niên vụ 2011 – 2012.

Môi trường phân lập vi khuẩn VA (Drysdale, Fleet, 1988; Ardhana, Graham H. Fleet 2003)

YGC Agar: glucose 50g/l (Merk), yeast extract 10g/l (Merk), CaCO3 30g/l (Merk), agar 20g/l , 0.1% cycloheximide, 50mg/l penicillin (Sigma), pH = 5.6. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 250C trong thời gian từ 5 – 8 ngày.

Môi trường quan sát hình thái tế bào và khả năng di động (Nielsen, 2007)

Môi trường lỏng YG ở nhiệt độ 250C trong thời gian từ 3 – 4 ngày.

Nhuộm gram

Bằng phương pháp nhuộm kép theo phương pháp Christian Gram.

Thiết bị sử dụng

Cân phân tích OHAUS, Model:PA 214, Mỹ. Máy đo pH, Model: Hi 211, HANNA, Italia. Tủ ấm SANYO, MIR 162, xuất xứ Nhật. Thiết bị theo dõi nhiệt độ cầm tay Model: Hi 39, HANNA, Italia. Kính hiển vi quang học, Model: B353FL, OPTIKA, Italia. Kính hiển vi soi nổi, Model: SZM-2, OPTIKA, Italia. Tủ cấy, bình định mức, bình tam giác, đũa thủy tinh, đĩa petri …và một số thiết bị khác.

Phương pháp nghiên cứu

Phân lập VA từ khối ủ cacao

 Tiến hành đập quả lấy hạt, ủ trong thùng gỗ, thời gian ủ 6 ngày, 2 ngày đảo hạt 1 lần và lấy mẫu theo từng ngày, mỗi lần lấy khoảng 200 g mẫu hạt tại 5 vị trí theo đường chéo và ở độ sâu 10cm trong khối ủ.

Tách phần cơm nhầy, nghiền mịn và trộn đều, pha loãng nồng độ từ nồng độ 10-2 đến 10-7 mỗi nồng độ cấy 3 đĩa, nuôi cấy 2 – 8 ngày trong tủ định ôn vô trùng ở nhiệt độ 250C, đếm và xác định mật độ vi khuẩn VA. Quan sát bằng mắt, nhận dạng, chọn và mô tả các dạng khuẩn lạc, đánh dấu và đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng đã được đánh dấu để làm thuần.

Phương pháp định danh VA dựa vào đặc điểm hình thái

Quan sát khuẩn lạc bằng mắt thường. Quan sát khả năng di động bằng cách làm tiêu bản giọt treo. Làm tiêu bản vi khuẩn không nhuộm và nhuộm Gram theo phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram, soi dưới kính hiển vi điện tử Optika B-350 ở vật kính 100. Dự đoán tên VA bằng hình thái dựa trên miêu tả của nhiều nguồn tài liệu (Nguyễn Lân Dũng 1976; Nguyễn Đức Lượng 2006, Ilse Cleenwerck 2008).

Phương pháp định danh VA bằng DNA

Mẫu cấy thuần. Lấy sinh khối vi khuẩn cho vào tube axygen có chứa 200 µl TE 1X, ly trích bằng phương pháp sốc nhiệt thu được DNA của vi khuẩn. Đo nồng độ DNA (25- 500ng/ reaction) bằng máy Biophotometer (Model 6131, Eppendoft, Đức, 2007). Lấy 5 µl mẫu cho vào phản ứng PCR để khuếch đại đặc hiệu đoạn DNA dài 500 bp trên vùng gen 16S rRNA của vi khuẩn bằng hệ thống máy PCR Thermal Cycler của Bio-Rad. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, chụp hình bằng hệ thống máy Gel Doc của Bio –Rad. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng bộ QIA quick PCR Purification Kit của QIAGEN.  Điện di sản phẩm đã tinh sạch bằng máy hệ thống máy Agilent 2100 Bioanalyzer (Model 2100, Hãng sản xuất Agilent, Mỹ, 2005). PCR SEQ sản phẩm đã tinh trước khi giải trình tự trên hệ thống máy ABI 3130XL (Model 3130XL, Aplied Biosystems, Mỹ, 2007). Phân tích kết quả bằng phần mềm sequencing analysis 5.3 (Aplied Biosystems, Mỹ, 2007)và so với kết quả trên ngân hàng gen thế giới (Genbank), (Phòng xét nghiệm Nam Khoa BIOTEK – ISO 15189).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả xác định mật độ VA trong mẫu cacao lên men

Qúa trình lên men hạt cacao được chia làm 2 giai đoạn chính: giai đoạn 48 giờ đầu thường là giai đoạn lên men yếm khí với sự hoạt động của nấm men chiếm ưu thế và giai đoạn sau 48 giờ là giai đoạn lên men hiếu khí với sự tham gia chính của VA. VA sử dụng cơ chất rượu ê ty líc để sản sinh acid acetic.

Kết quả phân lập cho thấy sự biến động của mật độ VA theo hướng chiếm ưu thế tại thời điểm 24 giờ; 48 giờ; 72 giờ, cao nhất tại thời điểm 72 giờ với mật độ 7,2 x 107 CFU/g vật chất khô, sau đó giảm dần đến cuối quá trình lên men. Mật độ khuẩn lạc thấp ở các thời điểm 0 giờ; 120 giờ;144 giờ, giao động từ 0,0018 – 0,588 x 105 CFU/g (Bảng 1). Nguyên nhân của sự biến động mật độ VA trong quá trình lên men trên là do tại các thời điểm 24, 48, 72 h hàm lượng cơ chất trong cơm nhầy dồi dào, môi trường thông thoáng hơn tại thời điểm 0 giờ do sự lên men và thoát dịch ra bên ngoài kết hợp với hàm lượng rượu ê ty líc tạo thành do hoạt động của nấm men nhiều, đây là điều kiện thích hợp cho sự hoạt động của VA. Đặc biệt tại thời điểm 72 giờ sau quá trình đảo hạt tại thời điểm 48h, môi trường hiếu khí hơn so với các thời điểm khác, kết hợp với môi trường dinh dưỡng dồi dào nên mật độ VA tăng nhanh. Sau 72 giờ môi trường thông thoáng hơn nhưng lượng cơ chất đã hết, bên cạnh đó phải cạnh tranh dinh dưỡng với các loài khác nên mật độ VA giảm mạnh. Kết quả trên cũng tương đồng với một số kết quả trên thế giới như: tại Mexico, mật độ VA đạt giá trị lớn nhất tại thời điểm 36 và 72h, sau đó giảm sau thời điểm 72h (T. Romero-Cortes, 2011), tại Cộng hòa Dominican Lagunes et al, (2007) cho kết quả hàm lượng ethanol cao ở 48 giờ và giảm mạnh tại 72h, tại thời điểm này xuất hiện acid acetic với mật độ cao, nghiên cứu của nhóm cũng cho thấy mật độ VA tại thời điểm 48h đạt giá trị cao nhất với mức 1,5 x 108 CFU/gam vật chất khô.

Bảng 1. Mật độ trung bình của VA trong mẫu hạt cacao qua các ngày lên men

Kết quả định danh tên VA bằng hình thái

Từ mẫu hạt cacao lên men, chúng tôi đã phân lập được 7 dạng VA khác nhau về hình thái khuẩn lạc như màu sắc, hình dạng, mặt cắt, bề mặt (bảng 2). Đây là một trong những cơ sở để xác định tên chi, tên loài VA. Bên cạnh đặc điểm hình thái khuẩn lạc, chúng tôi cũng tiến hành xác định hình thái tế bào khuẩn lạc và khả năng di động của chúng để có thêm cơ sở co việc định danh (bảng 3). Kết quả cho thấy hầu hết các dạng khuẩn lạc đều hình tròn, ướt, màu trắng, nâu nhạt và vàng nhạt (bảng 2). Tế bào có hình hạt, hình trụ ngắn, hình que (bảng 3).

Từ các kết quả trên Dự đoán tên VA bằng hình thái dựa trên miêu tả của các nguồn tài liệu (Nguyễn Lân Dũng 1976; Nguyễn Đức Lượng 2006; T. Romero-Cortes 2011; Ilse Cleenwerck 2008) chúng tôi bước đầu dự đoán thuộc các giống Acetobacter (dạng 1, 2, 3, 4, 6, 7) và Gluconobacter (dạng 5).

Bảng 2. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc VA

Bảng 3. Đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc VA

Kết quả định danh VA bằng DNA

Dựa vào kết quả giải trình tự gen 16S rRNA và kết quả tra cứu trên BLAST SEARCH kết luận các dạng VA có kết quả phân giải trình tự gen 16S rRNA có tên được trình bày trong (bảng 4, bảng 5)

Bảng 4. Kết quả xác định 7 dạng VA trong quá trình lên men cacao

Bảng 5. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA

Kết quả cho thấy có 2 dạng VA thuộc loài Acetobacter tropicalis, 4 dạng VA thuộc loài Acetobacter pasteurianus, và 1 dạng VA thuộc loài Acetobacter indonesiensis. Những loại VA mà chúng tôi phân lập được cũng là những loài thường xuyên xuất hiện trong khối ủ hạt cacao ở các nước trên thế giới như: Indonesia, thailand, Philippines, Ghana. Đây là các dạng có mật độ và tầng số xuất hiện cao trong khối ủ hạt cacao, chúng có vai trò cực kỳ quan trọng để tạo nên các phản ứng sinh hóa hình thành tiền hương vị sô cô la.

KẾT LUẬN

Mật độ VA qua 6 ngày lên men 0.18 x 105– 7.2 x 107 CFU/gam hạt tươi, đạt mật độ cao nhất tại thời điểm 72h.

Dựa vào đặc điểm khuẩn lạc, đặc điểm hình thái tế bào kết hợp với phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA cho kết quả 7 dạng VA thuộc 3 loài khác nhau là Acetobacter tropicalis (VA 1, VA 2), Acetobacter pasteurianus (VA 3, VA 4, VA 6, VA 7)  Acetobacter indonesiensis (VA 5).

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Ardhana MM, Fleet HG (2003), The microbial ecology of cocoa bean fermentations in Indonesia, Int. J. Food Microbiol., 86(1): 87–99.

D.S. Nielsen, O. D. T., L. Ban-Koffi, M. Owusu, T.S. Andersson, W.H. Holzapfel (2007). “The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations analysed using culture-dependent and culture-independent methods.” International Journal of Food Microbiology 114: 168–186.

Garcia AT, Papalexandratou Z, Hendryckx H, Camu N, Vrancken G, Vuyst L, Cornelis P (2010), Diversity of the total bacterial community associated with Ghanaian and Brazilian cocoa bean fermentation samples as revealed by a 16S rRNA gene clone library, Appl. Microbiol. Biotechnol., 87(6): 2281–2292.

Gilberto Vinícius de Melo Pereira, M. G. d. C. P. M., Cíntia Lacerda Ramos, Rosane Freitas Schwan (2012). “Microbiological and Physicochemical Characterization of Small-Scale Cocoa Fermentations and Screening of Yeast and Bacteria Strains for the Development of a Defined Starter Culture.” American Society for Microbiology.

Ilse Cleenwerck, A´ngel Gonzalez, Nicholas Camu, Katrien Engelbeen, Paul De Vos and Luc De Vuyst, Acetobacter fabarumsp. nov., an acetic acid bacterium from a Ghanaian cocoa bean heap fermentation, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2008), 58,2180–2185.

Lagunes GS, Loiseau G, Paredes JL, Barel M, Guiraud PJ (2007). Study on the microflora and biochemistry of cocoa fermentation in the Dominican Republic. Int. J. Food Microbiol., 114(1): 124–130.

Luc De Vuyst, Nicholas Camu, Tom De Winter, Katrien Vandemeulebreocke, Vincent Van de perre, Marc Vancanneyt, Paul De Vos, Ilse Cleenwerck, Validation of the (GTG)-rep-PCR fingerprinting technique for rapid classification and identification of acetic acid bacteria, with a focus on isolates from Ghanaian fermented cocoa beans, International Journal of Food Microbiology 125 (2008) 79–90.

Made M. Ardhana, G. H. F. (2003). “The microbial ecology of cocoa bean fermentations in Indonesia.” International Journal of Food Microbiology 86 (2003): 87– 99.

Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Anh Tuyết, 2003, Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 1, NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM.

Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạch, Phạm Văn Tỵ (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập II; 303-328. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

Nicholas Camu, Tom De Winter, Kristof Verbrugghe, Ilse Cleenwerck, Peter Vandemme, Jemmy S.Takrama, Marc Vancanneyt and Luc De Vuyst, Dynamics and biodiversity of populations of lactic acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneous heap fermentation of cocoa beans in Ghana, Applied and environmental microbiology, mar, 2007, p.1809-1824.

Nicholas Camu, Angel GonZalez, Tom De Winter, Ann Van Schoor, Katrien De Bruyne, Peter Vandemme, Jemmy S.Takrama, Solomon K.Addo and Luc De Vuyst, Influence of turning and environmental contamination on the dynamics of populations of lactic acid and acetic acid bacteria involved in spontaneous cocoa bean heap fermentation in Ghana, Applied and environmental microbiology, mar, 2007, p.1809-1824.

Nicholas Camu, Tom De Winter, Solomon K Addo, Jemmy S Takrama, Herwig Bernaert and Luc De Vuyst (2008),  Fermentation of cocoa beans: influence of microbial activitives and polyphenol concentrations on the flavor of chocolate, Journal of the science of Food and Agriculture, Sci Food Agric 88: 2288-2297 (2008).

Schwan RF, Wheals AE (2004), The microbiology of cocoa fermentation and its rule in chocolate quality, Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 44(4): 205-221.

Sandra Lagunes Gálvez, G. L., Jose Luis Paredes, Michel Barel, Joseph-Pierre Guiraud (2007). “Study on the microflora and biochemistry of cocoa fermentation in the Dominican Republic.” International Journal of Food Microbiology 114: 124–130.

Thompson SS, Miller KB, Lopez AS (2001), Cocoa and coffee, In Doyle et al. (eds) Food Microbiology  Fundamentals and Frontiers, ASM Press, Washington, DC. USA, pp. 721–736.

T. Romero-Cortes, V. Robles-Olvera, G. Rodriguez-Jimenes and M. Ramírez-Lepe, 2011, Isolation and characterization of acetic acid bacteria in cocoa fermentation, African Journal of Microbiology Research Vol. 6(2), pp. 339-347, 16 January, 2012.

Zoi Papalexandratou, G. F., Edwina Romanens, Juan Carlos Jimenez, Freddy Amores, Heide-Marie Daniel, and Luc De Vuyst (2011). “Species Diversity, Community Dynamics, and Metabolite Kinetics of the Microbiota Associated with Traditional Ecuadorian Spontaneous Cocoa Bean Fermentations.” Applied and environmental microbiology 77(21): p. 7698–7714.

 

SUMMARY

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ACETIC ACID BACTERIA IN WOODEN BOX COCOA FERMENTATION IN DAKLAK PROVINCE

Phan Thanh Binh *1, Nguyen Thi Thoa1, Nguyen Thi Mai1, Pham Van Thao1, Tran Thi Tham Ha1, Vo Van Thang1, Vo Thi Thuy Dung1, Tran Thi Hoang Anh, Nguyen Thị Hoai Tram

1The Western Highlands Agro-Forestry Scientific and Technical Institute

Acetic acid bacteria is very important role in the cocoa fermentation. They oxidize ethanol, which was produced by the yeast, to produce acetic acid. In the cocoa fermentation, acid acetic and temperature (which formed by biochemical-reaction) kill germ and break the wall cells, which make the ways of chemical compounds to contact together and change the color and quality of cocoa beans. Fermentation of cocoa beans is the first and most important stage to make the prescusor flavor, color and texture characteristics of cocoa beans in chocolate processing. Isolation and identification of some species of accetic bacteria are the first stage of researching the produce of cocoa flavor and quality and to complete the cocoa fermentation process for increasing and stable cocoa quality. Morphological characteristics and sequence analysis of 16S rRNA genes methods were used in this study. The results show that the number of CFU from 0.0018 x 107 to 7.2 x 107CFU/g dry matter. 7 different forms of bacteria were isolated and identified, which were the names of the 3 species, including Acetobacter tropicalis, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter indonesiensis.

Keywords: Acetobacter, cocoa, fermentation, identification, pulp

* Author for corresspondence: Tel: +84-500-3862845; Email: binhanphuochanh@gmail.com