Nguyễn Thị Mai, Vương Phấn, Trương Văn Tân
Viện Khoa học kỹ thuật NLN Tây Nguyên
SUMMARY
Study on the application of cell technology in propagation of
Coffea canephora clones with high yield and good quality
The research was carried out to establish a protocol of micropropagation by culturing leaf of some selected Coffea canephora clones via callus and somatic embryogenesis in WASI. The results showed that 1g embryogenic callus could produce about 80g torpedo embryos within 4-5 months. After about 5 months of germination phase, from 1g torpedo embryos we could select 160 plantlets, size ~10 mm, with one pair of true leaves and root for acclimatization in commercial coconut fibres under a greenhouse. After 2-3 months of acclimatization, there were about 140 plantlets developed at least two pairs of true leaves available for transplanting into PE bags and taken the same care as the seedlings.
- ĐẶT VẤN ĐỀ
Cà phê là cây trồng chủ lực của các tỉnh Tây Nguyên, trong đó diện tích cà phê vối chiếm trên 90%. Trong những năm gần đây bên cạnh các tiến bộ về thâm canh cây cà phê như tưới nước, bón phân, tạo hình … thì việc nghiên cứu giống cũng đạt được những kết quả đáng kể, đã tạo ra một số giống cà phê vối chọn lọc có năng suất cao, kích cỡ hạt lớn và khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao. Việc nhân giống vô tính các giống chọn lọc bằng phương pháp ghép được ứng dụng rộng rãi, nhưng còn nhiều hạn chế do hệ số nhân thấp, còn có hiện tượng tiếp hợp kém giữa chồi ghép và gốc ghép làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất của cây ghép, chi phí cao vì phải xây dựng các vườn cung cấp chồi nên chưa đáp ứng đủ lượng cây giống tốt.
Hiện nay trên thế giới việc nuôi cấy mô các loài cà phê đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Quá trình phát sinh phôi vô tính cây cà phê vối Coffea canephora được Staritsky báo cáo lần đầu tiên vào năm 1970; Sondahl và Sharp, 1977 cũng tạo được cây cà phê chè Coffea arabica từ phôi vô tính. Tiếp theo đó nhằm mục đích nhân giống cà phê nhiều tác giả đã nghiên cứu sự phát sinh phôi vô tính cây cà phê như Staristky và Van Hasselt (1980); Pierson và cộng tác viên (1983); Zamarripa và cộng tác viên (1991); Hatanaka và cộng tác viên (1991); Van Boxtel và Berthouly (1996), Ducos và cộng tác viên (1999, 2003) … Các công trình nghiên cứu này cho thấy có 3 tiến trình chính trong nhân nhanh cây cà phê bằng phương pháp phát sinh phôi vô tính, đó là: Nhân tế bào có tiềm năng phát sinh phôi và sản xuất phôi (giai đoạn thủy lôi) trong môi trường lỏng; Giúp phôi nảy mầm bằng cách làm ngập tạm thời phôi (giai đoạn có lá mầm) trong môi trường lỏng; Tạo điều kiện cho phôi nảy mầm phát triển thành cây con
Vì vậy nghiên cứu ứng dụng các tiến bộ về kỹ thuật nhân in vitro bằng phương pháp nuôi cấy phôi soma cho các dòng vô tính cà phê vối ưu tú đã được tuyển chọn là điều vô cùng cần thiết để đáp ứng nhu cầu cấp bách về giống tốt hiện nay của sản xuất.
- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu: 4 dòng vô tính cà phê vối: TR10, TR11, TR12, TR13 có năng suất cao, cỡ hạt lớn và khả năng kháng bệnh gỷ sắt cao.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Vào mẫu, tạo callus từ lá cà phê: Trước khi lấy mẫu lá, phun thuốc nấm trên lá, ngày một lần, trong 3 – 4 ngày. Hái lá bánh tẻ, rửa sạch, xử lý thuốc nấm và nhúng vào dung dịch Ethanol 70% trong 30 giây. Khử trùng bằng Hypochlorite Calci 10% trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng. Sau đó bỏ gân lá, rìa lá, 2 phần đầu, đuôi lá và cắt lá thành mảnh nhỏ (mỗi mảnh là một mẫu có kích thước khoảng 1cm2). Cấy mẫu lên môi trường thạch phát sinh callus, để trong tối.
+ Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối. Thí nghiệm gồm 6 công thức: CT1: Môi trường Yasuda et al, 1985 ; CT2 đến CT5 : Môi trường Yasuda cải tiến (với BA từ 0,5 mg/l đến 2 mg/l) ; CT6 : Môi trường Murashige & Skoog, 1962.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu tạo callus của các dòng vô tính trên các môi trường (%)
Tỷ lệ mẫu tạo callus được tính bằng % số mảnh lá phát sinh callus trên tổng số mảnh lá đem nuôi cấy.
+ Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối. Thí nghiệm gồm 6 công thức: CT1: Môi trường Pierson et al, 1983 ; CT2: đến CT5 : Môi trường Pierson cải tiến (thay IBA bằng 2,4-D từ 2 mg/l đến 5 mg/l) ; CT6 : Môi trường Murashige & Skoog, 1962.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ mẫu tạo callus của các dòng vô tính trên các môi trường (%)
Tỷ lệ mẫu tạo callus được tính bằng % số mảnh lá phát sinh callus trên tổng số mảnh lá đem nuôi cấy.
2.2.2. Nhân callus trong môi trường lỏng: Chuyển callus đã chọn lọc sang môi trường lỏng nhân callus, lắc tròn (110 – 120 vòng/phút). Sau 2 tuần, thay mới môi trường và tăng thể tích môi trường từ 10 ml lên 50 ml, 100 ml/bình tam giác. Quá trình lặp lại cho đến tuần thứ 8, các callus tăng về số lượng được sử dụng làm nguồn vật liệu cho quá trình sản xuất phôi.
Lượng callus đưa vào nhân : 0,5-1g/mỗi dòng vô tính
Chỉ tiêu theo dõi: + Khối lượng callus sau 2 tháng nuôi cấy lắc (%).
2.2.3. Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng: Callus được chuyển sang môi trường lỏng sản xuất phôi, đặt trên máy lắc tròn (110 – 120 vòng/ phút). Thay mới môi trường, cho đến khi phôi phát triển chủ yếu dưới dạng thủy lôi.
2.2.4. Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh: Trên môi trường thạch tái sinh cây, phôi vô tính cà phê ở dạng thủy lôi phát triển thành cây con có một cặp lá thật. Cây con có một cặp lá thật được đưa ra huấn luyện trên giá thể bột xơ dừa cho đến khi phát triển thành cây con có ít nhất hai cặp lá thật.
2.2.5. Phát triển cây con trong vườn ươm: Cây con mang hai cặp lá thật được ra ngôi trong bầu đất PE, chế độ chăm sóc giống như đối với cây con trồng bằng hạt.
2.3. Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thu thập được xử lý theo chương trình xử lý thống kê MSTATC và EXCEL.
- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khả năng phát sinh callus trên mẫu lá cà phê.
Trong quá trình thăm dò khả năng phát sinh callus của 4 dòng vô tính cà phê vối trên một số môi trường, ngoài một số phôi vô tính phát sinh trực tiếp trên mẫu có 4 dạng callus phát sinh như sau: callus màu trắng, mọng nước; callus màu xám, mọng nước; callus màu đen, cứng; callus màu vàng tươi hoặc vàng nhạt, hạt, bở.
Theo Ducos et al. (1999) chỉ chọn những callus màu vàng (tươi hoặc nhạt), dạng hạt, bở là callus có khả năng phát triển thành phôi (Embryogenic callus).
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ auxin và cytokinin đến khả năng tạo callus trên mẫu lá của 4 dòng vô tính cà phê vối thể hiện như sau:
Bảng 1. Tỉ lệ phát sinh callus có khả năng phát sinh phôi của 4 dòng vô tính cà phê vối sau 4-8 tháng vào mẫu (%)
|
DVT |
TR10 |
TR11 |
TR12 |
TR13 |
||||
|
Môi trường |
Thời gian (tháng) |
Tỉ lệ (%) |
Thời gian (tháng) |
Tỉ lệ (%) |
Thời gian (tháng) |
Tỉ lệ (%) |
Thời gian (tháng) |
Tỉ lệ (%) |
|
1. Yasuda, 1985 |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
5 |
16,0 |
6 |
10,7 |
|
2. Yasuda cải tiến bổ sung BA |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
|
3. Pierson, 1983 |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
8 |
100 |
> 8 |
0 |
|
4. Pierson cải tiến (5mg/l 2,4D) |
> 8 |
0 |
4 |
26,7 |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
|
5. Murashige & Skoog, 1962 |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
> 8 |
0 |
Kết quả cho thấy khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác nhau ở các môi trường thử nghiệm: Dòng TR10 không tạo callus có khả năng phát sinh phôi ở cả 5 môi trường. Tỉ lệ phát sinh callus có khả năng phát triển thành phôi của dòng TR11 trên môi trường Pierson cải tiến sau 4 tháng vào mẫu là 26,7% . Đối với dòng TR12 tỉ lệ này là 100% trên môi trường Pierson sau 5 tháng vào mẫu và 16 % trên môi trường Yasuda sau 8 tháng vào mẫu. Đối với dòng TR13 tỉ lệ này là 10,7 % trên môi trường Yasuda sau 6 tháng vào mẫu.
3.2. Nhân callus trong môi trường lỏng
Callus có khả năng phát sinh phôi (màu vàng, dạng hạt) được chuyển qua nhân trong môi trường lỏng. Khi sử dụng một lượng callus như nhau đưa vào nuôi cấy, sau 8 tuần trọng lượng callus tăng lên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, bình quân tăng 9,3 -10,6 lần so với trước khi nuôi cấy.
Bảng 2. Khối lượng callus tăng sau 2 tháng nuôi cấy (g)
|
Dòng vô tính |
Lượng callus trước nuôi cấy (g) |
Lượng callus sau nuôi cấy (g) |
Số lần tăng |
|
TR11 |
0,5 |
4,69 |
9,4 |
|
TR12 |
0,5 |
4,65 |
9,3 |
|
TR13 |
0,5 |
5,28 |
10,6 |
|
TB |
0,5 |
ns |
|
3.3. Tạo phôi cà phê dạng thủy lôi trong môi trường lỏng
Trên môi trường thử nghiệm, có 2 dòng vô tính TR11 và TR13 phản ứng tốt, kết quả được trình bày qua bảng 3:
Bảng 3. Khối lượng (g) và tỉ lệ (%) phôi dạng thủy lôi sau nuôi cấy
|
Dòng vô tính |
Lượng callus nuôi cấy (g) |
Lượng phôi sau 2-3 tháng (g) |
Lượng phôi dạng thủy lôi (g) |
Tỉ lệ phôi dạng thủy lôi (%) |
|
TR11 |
2 |
21,60 |
17,45 |
80,8 |
|
TR13 |
2 |
22,50 |
19,20 |
85,3 |
Đối với dòng vô tính TR11, tổng lượng phôi thu được sau 2 tháng nuôi cấy tăng hơn 10,8 lần, có 80,8% phôi phát triển thành dạng thủy lôi màu trắng. Đối với dòng vô tính TR13, tổng lượng phôi thu được sau 3 tháng nuôi cấy tăng 11,3 lần, tỉ lệ callus phát triển thành phôi dạng thủy lôi chiếm 85,3%.
Phôi dạng thủy lôi (kích thước từ 1-2 mm) là nguồn vật liệu cần thiết, thông qua giai đoạn phôi tiền nảy mầm và nảy mầm để tái sinh thành cây hoàn chỉnh
3.4. Tái sinh cây từ phôi và tạo cây con hoàn chỉnh
Các phôi dạng thủy lôi được trải đều trên môi trường thạch tái sinh (1g phôi/đĩa pétri ɸ 100 mm). Sau 3-5 tháng, từ 1g phôi ban đầu phát triển thành 155-160 cây con (kích thước ~ 10 mm, có một cặp lá thật, có rễ) và 500-550 phôi ở các giai đoạn khác nhau (kích thước < 2mm, từ 2-5 mm hoặc từ 5-10mm; chưa có lá mầm hoặc có lá mầm phát triển tốt, có rễ hoặc không có rễ). Chọn cây con có một cặp lá thật, có rễ đưa ra huấn luyện trên giá thể bột xơ dừa.
Bảng 4. Tỉ lệ sống (%) và khả năng phát triển của cây con có một cặp lá thật trên giá thể bột xơ dừa
|
Chỉ tiêu |
Sau 1 tháng |
Sau 2 tháng |
Sau 3 tháng |
Sau 4 tháng |
|
Tỉ lệ sống (%) |
90 |
88,3 |
88,3 |
88,3 |
|
Tỉ lệ cây có ít nhất 2 cặp lá thật (%) |
– |
58,8 |
100 |
100 |
Tỉ lệ sống sau hai tháng của cây con có 1 cặp lá thật trên giá thể bột xơ dừa là 88,3%. Sau 2 tháng đã có 58,8 % cây có ít nhất hai cặp lá thật, tỉ lệ này tăng dần và đạt 100% sau 3 tháng. Cây con có ít nhất hai cặp lá thật được cấy trong bầu đất đặt trong vườn ươm và chăm sóc như đối với cây trồng bằng hạt.
Như vậy từ 1 g phôi dạng thủy lôi, sau giai đoạn tái sinh và thích nghi trong giá thể bột xơ dừa có khoảng 140 cây con sống sót có ít nhất hai cặp lá thật có thể cấy vào bầu đất.
3.5. Phát triển cây con trong vườn ươm
Cây con mang hai cặp lá thật, sau 6 tháng cấy vào bầu đất trong vườn ươm, cây con in vitro sinh trưởng tốt , cây cao 22 – 25,3 cm, mang 7 – 8 cặp lá, có thể xuất vườn trồng ra ngoài đồng.
- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận.
– Khả năng phát sinh callus của các dòng vô tính cà phê vối khác nhau trên các môi trường: đối với TR11, sử dụng môi trường Pierson cải tiến (5mg/l 2,4D); đối với TR12, sử dụng môi trường Yasuda (1985) và Pierson (1983), đối với TR13, sử dụng môi trường Yasuda (1985).
– Trọng lượng callus sau 2 tháng nhân ở môi trường lỏng tăng từ 9,3 – 10,6 lần.
– Tỉ lệ callus chuyển sang phôi dạng thủy lôi từ 80 – 85,3%.
– Sau 5 tháng nuôi cấy trên môi trường thạch tái sinh, từ 1 g phôi dạng thủy lôi, tái sinh 155-160 cây con (kích thước ~ 10 mm, có một cặp lá thật, có rễ). Sau giai đoạn thích nghi trong giá thể bột xơ dừa từ 2-3 tháng có khoảng 140 cây con có ít nhất 2 cặp lá thật, cấy vào bầu đất và chăm sóc như với cây trồng bằng hạt.
– Sau 6 tháng ra ngôi trong vườn ươm, cây cà phê vối in vitro cao 22 – 25,3 cm, mang 7-8 cặp lá, có thể xuất vườn trồng ra ngoài đồng.
4.2. Đề nghị.
– Ứng dụng kết quả để xây dựng qui trình kỹ thuật nhân giống cho 2 dòng vô tính TR11 và TR13 bằng phương pháp tạo phôi soma.
– Tiếp tục nghiên cứu ở các dòng vô tính khác.
– Tiếp tục nghiên cứu giai đoạn tái sinh cây từ phôi trong môi trường lỏng (thông qua hệ thống Bioreactor) để giảm công cấy chuyền phôi trong môi trường thạch, góp phần đưa qui trình ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Ducos J.P., Gianforcaro M., Florin B., Petiard V., Deshayes A., 1999- A technically and economically attractive way to propagate elite Coffee canephora clones: in vitro somatic embryogenesis. ASIC, 18e Colloque, Helsinke, 295-300.
- Ducos J.P., Aleton R., Reano J.F., Kanchanomai C., Deshayes A., Petiard V. (2003) – Agronomic perfomance of Coffea canephora trees derived from large-scale somatic embryo production in liquid medium. Euphytica 131: 205-223
- Hatanaka T., Arakawa O., Yasuda T., Uchida N., Yamaguchi T., 1991- Effect of plant growth reglators on somatic embryogenesis in leaf cultures of Coffea canephora. Plant Cell Reports. 17: 179-182.
- Pierson E.S., Van Lammeren A.A.M., Schel J.H.N., Staritsky G., 1983- In vitro development of embryoids from punched leaf dishes of Coffea canephora. Protoplasma. 115: 208-216.
- Sondhal M.R., Sharp W.R., 1977- High frequency induction of somatic embryos in cultured leaf explants of arabica L. Zeitschrift fur Pflanzenphysiologie, 81: 395-408.
- Starisky G., 1970- Embryoid formation in callus cultures of coffee. Acta Bot Neerl. 19(4): 509-514.
- Starisky; G., Van Hasselt G.A.M., 1980- The synchronise mass propagation of Coffea canephora in vitro, ASIC, 9e Colloque, 597-602.
- Van Boxtel J., Berthouly M., 1996- High frequency somatic embryogenesis from coffee leaves. Plant Cell Tissue & Organ Cul. 44: 7-17.
- Yasuda T.; Fufjii Y and Yamaguchi T. , 1985– Embryogenic callus induction from Coffea arabica leaf explant by benziladenine. Plant and Cell Physiology, 26, no. 3, p. 595-597.
- Zamarripa A. , Ducos J.P., Tessereau H. , Bollon H. , Eskes A.B. , Petiard V. (1991)- Production of coffee somatic embryos in liquid medium: effect of inoculation density and renewal of the medium. Café Cocoa Thé 1991; 35: 233–244
QUI TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO CÂY CÀ PHÊ VỐI
(Viện KHKT NLN Tây Nguyên, 2010)
(Kết quả nghiên cứu khoa học & Công nghệ 2006 – 2010 – Viện Khoa học kỹ thuật Nông lâm nghiệp Tây Nguyên)