Nguyễn Thị Mai
Phòng Sinh hóa & Công nghệ Sinh học
TÓM TẮT: Các diode phát quang (Light Emiting Diode-LED) đang được ứng dụng rộng trong nuôi cấy mô thực vật do có hiệu quả chiếu sáng cao, thuận tiện cho việc thiết kế và lắp đặt, chi phí năng lượng thấp. Nghiên cứu được thực hiện với mục đích khảo sát khả năng ứng dụng đèn LED trong nuôi cấy in vitro cây cà phê vối năng suất cao giống TR11. Sau 6 tháng nuôi cấy, các mảnh lá nuôi cấy dưới các điều kiện ánh sáng khác nhau đều phát sinh mô sẹo. Tuy nhiên, các mẫu lá nuôi cấy dưới điều kiện ánh sáng LED 4 (41%R: 21%B: 38%W) cho tỷ lệ tạo mô sẹo có khả năng phát sinh phôi cao nhất (81,48% tổng số mẫu mô sẹo). Các ánh sáng LED nhìn chung cho tỷ lệ nảy mầm của phôi soma cao hơn cũng như thời gian nảy mầm ngắn hơn so với ánh sáng đối chứng. Có 95% số phôi nảy mầm ở ánh sáng LED 2 (58%R: 21%B: 21%W) sau 20 ngày nuôi cấy và chỉ 83,22% số phôi nảy mầm sau 30 ngày sinh trưởng dưới ánh sáng trắng. Mặc dù ánh sáng LED gây bất lợi đến giai đoạn phát triển từ cây mầm thành cây hoàn chỉnh, tuy nhiên, kết quả theo dõi ở điều kiện nhà lưới cho thấy các cây nuôi cấy dưới đèn LED vẫn có khả năng sinh trưởng tốt sau 2 tháng ra cây. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ánh sáng LED có khả năng thay thế ánh sáng huỳnh quang với hiệu quả cao hơn trong một số giai đoạn tái sinh cây cà phê vối như tạo mô sẹo từ mảnh lá và phát sinh cây mầm từ phôi soma.
MỞ ĐẦU
Giống cà phê vối TR11 là một trong những giống cao sản đang được canh tác tại Tây Nguyên. Đây là giống cà phê sinh trưởng nhanh, cây cao, tán rộng, phân cành ít, năng suất cao (5-7 tấn/ha),tỷ lệ hạt loại 1 > 90%. Hiện nay, giống cà phê vối TR11 đang được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro nhằm cung cấp lượng lớn cây giống đồng nhất có chất lượng cao.
Các phòng nuôi cấy mô thực vật hiện đang sử dụng bóng đèn huỳnh quang làm nguồn sáng nhân tạo, tuy nhiên, đèn huỳnh quang có một số nhược điểm như: tuổi thọ bóng thấp, điện năng tiêu thụ cao, nhiệt lượng phát sinh trong quá trình sử dụng lớn. Các diode phát quang (LED) có thể khắc phục được những nhược điểm nêu trên. Tuy nhiên, ánh sáng là nhân tố quan trọng đối với quá trình sinh trưởng phát triển của thực vật, do đó cần khảo sát kỹ lưỡng ảnh hưởng của ánh sáng LED đến thực vật trước khi ứng dụng trên quy mô lớn.
Hiện nay, trên thế giới cũng như trong nước chưa có nghiên cứu nào đánh giá mức độ ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng khác nhau đặc biệt là ánh sáng LED đến cây cà phê vối cũng như giống cà phê TR11. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục đích đánh giá khả năng ứng dụng của ánh sáng LED trong nhân giống in vitro cây cà phê vối giống TR11.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Giống cà phê vối năng suất cao TR11 in vitro do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên cung cấp.
Phương pháp bố trí thí nghiệm: Tiến hành đánh giá ảnh hưởng của ánh sáng LED đến các giai đoạn tái sinh in vitro cây cà phê: (1) hình thành mô sẹo từ lá cây in vitro; (2) quá trình nảy mầm và sinh trưởng của cây mầm và (3) huấn luyện cây trưởng thành. Mỗi điều kiện khảo sát với 10 bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường. Tiến hành đánh giá ảnh hưởng của ánh sáng LED đến cây cà phê qua các chỉ tiêu hình thái và sinh lý của mẫu nuôi cấy như: tỷ lệ mẫu phát sinh mô sẹo; thời gian cảm ứng tạo mô sẹo, hình thái mô sẹo; tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi; tỷ lệ mẫu tạo cây hoàn chỉnh.
Điều kiện ánh sáng khảo sát: Hệ thống đèn LED khảo sát bao gồm các đèn LED do ánh sáng LED đỏ (R), LED xanh (B) và LED trắng (W) kết hợp theo tỷ lệ khác nhau: LED 1 (72%R: 14%B: 14%W), LED 2 (58%R: 21%B: 21%W), LED 3 (21%R: 21%B: 58%W), LED 4 (41%R: 21%B: 38% W), LED 5 (80% R: 20% B) và ánh sáng trắng huỳnh quang đối chứng.
Phương pháp xử lý số liệu: Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần, số liệu được xử lý với phần mềm Microsoft excell 2007 và Statgraphic XV theo phương pháp Ducan với α = 0,05.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hưởng của ánh sáng LED đến khả năng tạo mô sẹo từ lá cây cà phê in vitro.
Các mẫu lá được cấy trên môi trường tạo mô sẹo và nuôi cấy dưới những điều kiện chiếu sáng khác. Sau 6 tháng nuôi cấy, các mẫu nuôi cấy trong điều kiện tối, ánh sáng huỳnh quang, và các ánh sáng LED 1, 2, 4 đều có tỷ lệ mẫu phát sinh mô sẹo cao (dao động từ 88,15% đến 94,45%) (bảng 1). Mặt khác, ánh sáng LED 3 và LED 5 có tỷ lệ tạo thành mô sẹo thấp, chỉ có 61,11% số mẫu lá tạo sẹo ở ánh sáng LED 3 và 57,78% ở LED 5 (bảng 1).
|
Bảng 1: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến khả năng phát sinh mô sẹo phôi. |
||||||
|
Điều kiện chiếu sáng |
Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%) |
Tỷ lệ các kiểu mô sẹo tạo thành |
Khối lượng tươi |
|||
|
Vàng tươi, dạng hạt (%) |
Vàng tươi dạng bở (%) |
Các dạng mô sẹo không phát sinh phôi (%) |
Vàng tươi, dạng hạt (g) |
Vàng tươi dạng bở (g) |
||
|
Tối |
91.49 |
28,15 |
20,37 |
42,92 |
0,06*a |
0,08*a |
|
Neon |
92,22 |
10,74 |
0 |
81,48 |
0,03*b |
– |
|
LED 1 |
88,15 |
0 |
56,30 |
31,85 |
– |
0,48bc |
|
LED 2 |
94,45 |
0 |
67,78 |
26,67 |
– |
0,56bc |
|
LED 3 |
61,11 |
0 |
0 |
61,11 |
– |
– |
|
LED 4 |
92,96 |
0 |
81,48 |
11,48 |
– |
0,68b |
|
LED 5 |
57,78 |
0 |
0 |
57,78 |
– |
– |
(*) Kết quả trung bình của 3 lần lặp lại; các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt ở mức α = 5%.
Hình 1. Ảnh hưởng của ánh sáng đến các giai đoạn sinh trưởng của cây cà phê
a. Mô sẹo dạng vàng tươi, hạt; b. Mô sẹo dạng trắng, mọng nước; c. Mô sẹo tăng sinh trong muôi lỏng dưới đèn huỳnh quang; d. Phôi dạng thủy lôi phát sinh dưới ánh sáng huỳnh quang; e-f. Phôi hai lá mầm dưới ánh sáng trắng và LED 2; g-h. Cây tạo lá thật dưới ánh sáng huỳnh quang và LED 2; i-j. Cây cà phê sau 2 tháng huấn luyện trong nhà lưới của cây nuôi dưới đèn huỳnh quang và LED 5; k. Cây cà phê TR11 sau 6 tháng huấn luyện trong nhà lưới.
Ánh sáng không chỉ ảnh hưởng tới tỷ lệ mẫu phát sinh mô sẹo mà còn tác động tới chất lượng mô sẹo tạo thành. Sau 6 tháng nuôi cấy dưới các điều kiện ánh sáng khác nhau, điều kiện đèn LED 4 có tỷ lệ mẫu mô sẹo có khả năng phát sinh phôi cao nhất (81,48%), bao gồm cả hai loại mô vàng tươi dạng hạt và vàng nhạt bở (hình 1a). Trong khi đó, các mẫu lá nuôi cấy dưới ánh sáng LED 3 và LED 5 (hình 1b) không có khả năng tạo thành dạng mô sẹo có khả năng phát sinh phôi (bảng 1). Ngoài ra, các mẫu được nuôi cấy dưới điều kiện ánh sáng huỳnh quang có tỷ lệ mô sẹo phôi thấp nhất (10,74%). Tuy nhiên, qua quá trình theo dõi chúng tôi nhận thấy chỉ có các mẫu lá nuôi cấy dưới điều kiện tối và huỳnh quang mới tạo dạng sẹo vàng tươi dạng hạt (bảng 1). Đây là dạng mô sẹo có tiềm năng phát sinh phôi cao hơn cả. Như vậy ánh sáng LED có ảnh hưởng lớn đến khả năng phát sinh mô sẹo cũng như tỷ lệ mô sẹo có khả năng phát sinh phôi.
Tác động của ánh sáng LED đến quá trình nảy mầm của phôi soma.
Các mô sẹo có màu vàng tươi dạng hạt và vàng nhạt dạng bở sau khi được nhân lên và tạo thành phôi soma trong môi trường lỏng lắc, có dạng thủy lôi màu trắng, kích thước 2-3 mm được cấy chuyển sang môi trường đặc và nuôi cấy dưới các điều kiện ánh sáng khác nhau. Kết quả cho thấy, các mẫu phôi nuôi cấy dưới các điều kiện ánh sáng LED có thời gian phát sinh lá mầm ngắn hơn, cũng như tỷ lệ phôi tạo lá mầm cao hơn so với các mẫu phôi được nuôi cấy dưới ánh sáng huỳnh quang (bảng 2). Thời gian nảy mầm trung bình của các phôi sinh trưởng dưới ánh sáng huỳnh quang là 30 ngày, trong khi các phôi nuôi cấy dưới các điều kiện ánh sáng LED nảy mầm sau 20 ngày nuôi cấy. Sau 20 ngày nuôi cấy, hầu hết các mẫu phôi nuôi cấy dưới ánh sáng LED đều đã nảy mầm và hai lá mầm mở rộng. Trái lại, hai lá mầm của các mẫu sinh trưởng dưới ánh sáng trắng vẫn chưa mở rộng (hình 1e, f )
|
Bảng 2: Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nảy mầm của phôi soma cây cà phê |
|
||||
|
Các điều kiện chiếu sáng |
Tỷ lệ phôi phát sinh lá mầm (%) |
Thời gian nảy mầm |
Khối lượng tươi (mg) |
Diện tích lá mầm ( cm2) |
|
|
Huỳnh quang |
83,22 |
30 |
9,07*a |
0,064*a |
|
|
LED 1 |
91,89 |
20 |
13,76b |
0,116c |
|
|
LED 2 |
95,00 |
20 |
13,82b |
0,104bc |
|
|
LED 3 |
90,00 |
20 |
11,50ab |
0,091b |
|
|
LED 4 |
93,33 |
20 |
12,36b |
0,103bc |
|
|
LED 5 |
84,78 |
20 |
13,71b |
0,122c |
|
(*) Kết quả trung bình của 3 lần lặp lại; các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt ở mức α = 5%.
Tỷ lệ phôi phát sinh lá mầm ở ánh sáng trắng đối chứng là 83,22%, trong khi đó có đến 95% mẫu nảy mầm ở đèn LED 2; 93,33% ở LED 4; 91,89% ở LED 1 và 90% ở LED 3. Trong các kiểu đèn LED thí nghiệm, các mẫu sinh trưởng dưới đèn LED 5 có tỷ lệ phôi nảy mầm thấp nhất (84,78%).
Ảnh hưởng của ánh sáng LED đến quá trình tạo cây cà phê hoàn chỉnh in vitro.
Sau thời gian 4 tháng nuôi cấy, tỷ lệ phôi mầm phát triển thành cây có lá thật ở ánh sáng trắng cao hơn so với các ánh sáng LED khảo sát (bảng 3). Tỷ lệ này ở đèn huỳnh quang đạt 63,78% trong khi chỉ đạt 29,11-39,22% ở đèn LED.
Các ánh sáng cũng ảnh hưởng tới hình thái cây cà phê tạo thành. Chiều cao cây trung bình của cây sinh trưởng dưới ánh sáng trắng là 1,35 cm (bảng 3) tương tự với các chồi sinh trưởng dưới ánh sáng LED 1, LED 2 và LED 5. Mặt khác, sự kết hợp các kiểu ánh sáng ở đèn LED 4 lại gây ức chế đến khả năng tăng chiều cao của cây (bảng 3). Số cặp lá tạo thành/cây cũng có sự khác biệt rõ ràng giữa các kiểu đèn khảo sát. Các ánh sáng LED phần lớn cho chỉ tiêu số lá/cây thấp hơn so với ánh sáng trắng (hình 1g, h), tuy nhiên, số liệu thống kê cho thấy, chỉ có các chồi sinh trưởng dưới hai kiểu đèn LED1 và LED 2 có số lá trung bình/cây tương đương với các chồi ở ánh sáng trắng.
|
Bảng 3: Ảnh hưởng của ánh sáng đến sinh trưởng của cây cà phê in vitro và vườn ươm. |
|||||
|
Các điều kiện chiếu sáng |
Tỷ lệ phôi mầm tạo cây có lá thật (%) |
Cây in vitro sau 4 tháng |
Cây trong vườn ươm sau 2 tháng |
||
|
Chiều cao cây (cm) |
Số cặp lá/cây |
Cao cây (cm) |
Số cặp lá |
||
|
Huỳnh quang |
63,78 |
1,35a |
3,22ab |
2,16a |
4,04a |
|
LED 1 |
37,78 |
1,40a |
3,56a |
1,90ab |
3,15bc |
|
LED 2 |
39,22 |
1,48a |
3,11b |
1,78cb |
3,22bc |
|
LED 3 |
34,33 |
1,28ab |
2,67c |
1,52c |
2,89c |
|
LED 4 |
29,11 |
0,83b |
2,00d |
1,78ab |
3,56b |
|
LED 5 |
33,67 |
1,37a |
2,22d |
1,89ab |
4,18a |
(*) Kết quả trung bình của 3 lần lặp lại; các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt ở mức α = 5%.
Qua các khảo nghiệm, chúng tôi nhận thấy: trong quá trình hình thành lá thật, cây không chỉ sử dụng các phổ ánh sáng đơn sắc thí nghiệm mà còn có thể cần đến các phổ sóng khác trong dải bước sóng do ánh sáng huỳnh quang cung cấp.
Các chồi cây 4 tháng tuổi tiếp tục được đánh giá khả năng sinh trưởng trong điều kiện nhà lưới, với mục đích khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện ánh sáng đến chất lượng cây nuôi cấy mô ngoài tự nhiên.
Đánh giá khả năng sinh trưởng trong vườn ươm của cây cà phê nuôi cấy in vitro dưới các ánh sáng khác nhau.
Cây cà phê vối nuôi cấy dưới ánh sáng LED có thời gian thích nghi với điều kiện nhà lưới lâu hơn 1 tháng so với ánh sáng huỳnh quang. Khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra vườn ươm, trong khi cây nuôi cấy dưới ánh sáng trắng có thể thích nghi ngay thì cây nuôi cấy dưới đèn LED phải nuôi dưới điều kiện tự nhiên 1 tháng trong bình nuôi trước khi chuyển sang giá thể. Khi không có giai đoạn thích nghi, các cây nuôi cấy dưới đèn LED đều có hiện tượng đen, nâu chồi và chết sau 4 tuần trồng trên giá thể.
Sau giai đoạn tập thích nghi, các chồi cà phê được chuyển ra giá thể. Qua 2 tuần theo dõi, chúng tôi nhận thấy không còn hiện tượng vàng lá và nâu lá ở những cây khảo sát (hình 1j). Sau 8 tuần trồng trong nhà lưới, sinh trưởng của cây nuôi cấy dưới ánh sáng LED và cây nuôi cấy dưới ánh sáng trắng không khác nhau (bảng 3). Kết quả cho thấy có thể một số chỉ tiêu đánh giá sinh trưởng của cây nuôi cấy trong điều kiện in vitro dưới đèn LED thấp hơn so với đèn huỳnh quang nhưng khả năng sinh trưởng của cây giống trong điều kiện nhà lưới của những cây nuôi cấy dưới đèn LED vẫn được đảm bảo (hình 1 i, j, k).
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã đánh giá bước đầu về ảnh hưởng của ánh sáng LED đến tái sinh cây cà phê vối giống TR11, một cây công nghiệp quan trọng của Việt Nam. Việc sử dụng các ánh sáng LED làm rõ nhu cầu ánh sáng của cây cà phê trong từng giai đoạn không giống nhau. Ánh sáng LED tác động tích cực đến các giai đoạn tạo mô sẹo phôi từ lá với hiệu quả cao (81,48% mẫu lá tạo mô sẹo phôi ở LED 4) và giai đoạn nảy mầm của phôi thủy lôi thành cây mầm với tỷ lệ nảy mầm lên đến 95% sau 20 ngày nuôi cấy ở LED 2. Mặc dù có thời gian huấn luyện dài hơn nhưng các cây nuôi cấy dưới ánh sáng LED sinh trưởng trên giá thể tương đương với ánh sáng trắng. Điều này cho thấy tiềm năng ứng dụng công nghệ chiếu sáng LED trong nuôi cấy mô cây cà phê với ưu điểm giảm thiểu chi phí năng lượng với chất lượng cây tương đương với quy trình nuôi cấy dưới ánh sáng trắng.