Nguyễn Văn Thường, Trần Thị Hoàng Anh và CTV
Viện KHKT Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên
1.GIỚI THIỆU
Sử dụng hệ thống bioreactor-RITA trong nhân giống cà phê chè TN1 là nội dung thuộc đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu xây dựng hệ thống nhân giống cây cà phê chè (Coffea arabica) bằng công nghệ bioreactor” do Viện KHKT Nông lâm nghiệp Tây Nguyên thực hiện từ năm 2014.
Diện tích cà phê chè của Việt Nam hiện nay khoảng 35.000 ha trong đó trên 90% diện tích được trồng bằng giống Catimor. Catimor có đặc điểm thấp cây, chống chịu cao với một số bệnh nguy hại, đặc biệt là bệnh rỉ sắt cà phê. Trong điều kiện thuận lợi Catimor có thể đạt năng suất từ 2,5 – 3,0 tấn nhân/ha, khối lượng 100 hạt trung bình 15 gam và tỉ lệ hạt trên sàng số 16 khoảng 70%. Tuy vậy chất lượng mùi vị nước uống của Catimor được cho là thua kém một số giống cà phê chè thuần chủng như Buorbon và Typica.
Để cải thiện năng suất và chất lượng cà phê chè Việt Nam, từ đầu những năm 1990 Viện KHKT Nông lâm nghiệp Tây Nguyên đã thực hiện các chương trình lai tạo và chọn lọc giống cà phê chè và đã chọn được một số giống mới, trong đó có TN1 được Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận giống mới vào năm 2011. TN1 là con lai thế hệ F1 (lai giữa một vật liệu nhập từ Ethiopia ký hiệu KH3-1 với giống Catimor) có năng suất từ 3,0-3,5 tấn nhân/ha; khối lượng 100 hạt trên 17 gam, tỉ lệ hạt trên sàng số 16 đạt trên 90% và điểm mùi vị nước uống tốt hơn hẳn Catimor. Do TN1 là giống lai ở thế hệ đầu nên nếu nhân giống bằng hạt thì trong quần thể đời con sẽ có sự biến động rất lớn về các đặc điểm liên quan năng suất và chất lượng, vì vậy TN1 cần được nhân bằng phương pháp vô tính. Trong nhân vô tính, phương pháp nhân giống in vitro có nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp ghép và giâm cành do đạt hệ số nhân rất cao. Theo phương pháp này, khối mô sẹo (callus) được tạo ra từ mẫu lá sẽ được nuôi cấy để tái sinh phôi trước khi tạo thành cây hoàn chỉnh; tế bào mô sẹo có thể phân chia theo cấp số nhân và khi phân hóa thành phôi vô tính sẽ tạo ra số lượng lớn phôi trong thời gian ngắn. Các phôi vô tính tiếp tục được nuôi cấy để phát triển thành cây con có lá mầm. Ở giai đoạn này , theo công nghệ cũ, các phôi được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng trong các bình tam giác thường cho hệ số nhân giống thấp và thời gian nảy mầm của phôi thường kéo dài trên 5 tháng. Để khắc phục nhược điểm trên, nhằm tăng hệ số nhân và rút ngắn thời gian tái sinh phôi thành cây con, đề tài đã sử dụng các bình RITA của hệ thống Bioreactor thay cho các bình tam giác.
Nhân giống cà phê in vitro sử dụng hệ thống Bioreactor đã được áp dụng ở quy mô lớn tại nhiều nước như Pháp, Thái Lan và Indonesia. Chỉ riêng Indonesia hằng năm cung cấp hàng triệu cây giống cà phê nhân bằng công nghệ Bioreactor.
Bioreactor có một số biến thể. Riêng hệ thống Bioreactor – RITA gồm 5 bộ phận chính:
– Máy nén khí (bơm khí tạo áp lực để hút/đẩy môi trường từ ngăn chứa môi trường lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại);
– Bảng cài đặt thời gian (điều khiển chu kỳ ngập/ chu kỳ sục khí);
– Hệ thống ống dẫn khí và van điều khiển;
– Các màng lọc vô trùng;
– Các bình nuôi cấy (RITA) chế tạo bằng polycarbonate. Mỗi bình có dung tích 1 lít và chia làm 2 ngăn: ngăn phía trên chứa phôi hoặc cây và ngăn phía dưới chứa môi trường lỏng.
Bình RITA hoạt động theo 4 pha (Hình 1). Trong thời gian làm ngập ngăn trên, môi trường nuôi cấy chuyển động xoáy ốc từ dưới lên với tốc độ chậm làm cho mẫu cấy xoay trở và các mặt đều được tiếp xúc với môi trường, lượng không khí sau đó được thoát ra bên ngoài thông qua ống thoát có màng lọc không khí. Dinh dưỡng trong bình được duy trì trong suốt thời gian nuôi cấy mà không cần thay mới môi trường, điều này làm giảm mức độ nhiễm nấm, vi khuẩn của các phôi và tế bào trong bình, giảm được công cấy chuyền và tăng tỷ lệ phát sinh lá mầm, rễ và sinh khối cây.
|
Pha 1: Tĩnh – mẫu cấy bên trên, môi trường lỏng bên dưới, ngăn cách bằng đĩa nhựa đục lỗ, Pha 2: Sục khí – các van mở ra, không khí đi vào qua các màng lọc tạo áp lực đẩy môi trường lỏng lên ngập mẫu cấy (phôi hoặc cây), Pha 3: Trao đổi khí trong bình RITA, Pha 4: Dừng sục khí, các van đóng lại, môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới. Chu kỳ kết thúc. |
 |
|
Hình 1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của bình RITA (Teisson C. và Alvard D., 1995) |
|
2. KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
Kết quả chính đạt được của đề tài là xây dựng và hoàn thiện quy trình nhân giống TN1 bằng công nghệ Bioreactor. Các công đoạn của quy trình được minh họa trong sơ đồ Hình 2.
Mô tả các bước quy trình
– Tạo mẫu sạch : Chọn mẫu lá không bị sâu bệnh, rửa sạch dưới vòi nước chảy, sau đó nhúng vào dung dịch khử trùng mẫu. Sản phẩm yêu cầu đạt được của công đoạn này là mẫu lá vô trùng làm vật liệu để tạo tế bào mô sẹo.
– Tạo tế bào mô sẹo: Mẫu lá vô trùng được cấy lên môi trường kích thích phản ứng của tế bào tạo mô sẹo. Sản phẩm của công đoạn này là các tế bào mô sẹo từ mẫu lá để làm vật liệu cho công đoạn tăng sinh khối mô sẹo.
– Tăng sinh khối mô sẹo: Chọn tế bào mô sẹo có khả năng tái sinh, tăng hệ số nhân đưa vào nuôi cấy trong môi trường lỏng được lắc thường xuyên trên máy lắc. Sản phẩm của công đoạn này là khối lượng mô sẹo được tăng lên và có khả năng tái sinh thành phôi.
– Tái sinh phôi: Mô sẹo được cấy vào môi trường lỏng và được lắc để tạo phôi. Sản phẩm của công đoạn này là phôi cà phê có khả năng tạo thành cây hoàn chỉnh.
– Phôi phát triển thành cây có lá mầm: Chọn lọc những phôi không bị biến dạng bất thường, đưa vào bình RITA của hệ thống bioreactor để nuôi cấy. Sản phẩm công đoạn này là phôi có lá mầm với số lượng lớn (khoảng từ 400 tới 1.000 cây/ mỗi bình RITA). Các phôi có lá mầm được cấy chuyền vào các bình tam giác có môi trường nuôi cấy và sản phẩm là cây giống có 1-3 cặp lá thật đồng nhất .
– Huấn luyện chăm sóc cây ngoài vườn ươm: Chọn cây con có rễ cọc và 1-2 cặp lá đem cấy vào giá thể, chăm sóc và huấn luyện ngoài vườn ươm tới khi đạt tiêu chuẩn xuất vườn.
Đã có 2500 cây con của giống TN1 sản xuất theo quy trình trên được trồng trong mô hình thử nghiệm tại Đăk Lak từ năm 2015. Kết quả bước đầu cho thấy sau 3 tháng trồng tỉ lệ cây sống đạt trên 97%; cây sinh trưởng, phát triển tốt và giữ nguyên đặc điểm của giống TN1.
Trong các công đoạn nêu trên, tái sinh phôi thành cây có lá mầm trong các bình RITA là công đoạn quan trọng và quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân giống cây cà phê chè. Kết quả nghiên cứu về công đoạn này cho thấy: Trong các bình RITA, sử dụng môi trường nuôi cấy MS được bổ sung đường với hàm lượng 10 g/lít, thời gian sục khí 1 phút sau mỗi chu kỳ 6 giờ, thể tích môi trường nuôi cấy trong mỗi bình 300 ml và pH môi trường nuôi cấy 5,8 là những điều kiện thích hợp nhất cho quá trình phôi vô tính phát sinh lá mầm và quá trình phát triển của cây con, làm tăng hệ số nhân, tăng tốc độ phát triển của cây và rút ngắn được thời gian sản xuất cây giống từ 2-3 tháng so công nghệ cũ (cho phôi nảy mầm trong các bình tam giác).
Hình 2. Sơ đồ các công đoạn trong quy trình nhân giống cây cà phê chè sử dụng hệ thống Bioreactor – RITA
Hình 3. Sự phát triển của phôi (a) thành cây có lá mầm sau 8 tuần trong bình RITA (b) và cây con trồng ngoài đồng (c)
3. KHUYẾN NGHỊ
Công nghệ Bioreator – RITA có nhiều ưu điểm nổi trội,vì vậy đề nghị sử dụng công nghệ này thay thế hoàn toàn việc sử dụng bình tam giác ở giai đoạn tái sinh phôi thành cây có lá mầm trong quy trình nhân giống in vitro.