Vương Phấn, Nguyễn Thị Mai, Trương Văn Tân, Nguyễn Văn Thường
Viện Khoa học kỹ thuật NLN Tây Nguyên
SUMMARY
Study on in vitro propagation of some F1-hybrids of Coffea arabica
by tissue culture method
The research was carried out to establish a protocol of micropropagation for some F1-hybrids of Coffea arabica by direct somatic embryogenesis method from leaf in WASI. The results showed that after 4-6 months of culture in the MS medium supplemented with 2ip (1,5 mg/l), the percentages of 2 F1-hybrids (TN2, TN4) producing directly embryos were 80-85%, averagely obtained of 80-90 embryos/cm2 of leave. After about 2 months of acclimatization in commercial coconut fibre substrate under a greenhouse, the plantlets with one pair of true leaves and roots developed into the plantlets with two pairs of true leaves (51,2%) available for transplanting into PE bags contained soil and taken the same care as the seedlings. After 6 months under nursery, the in vitro plants attained the height of 22,5cm to 23 cm and about 7 pairs of true leaves could be planted in the field. They initially grew and developed well.
- ĐẶT VẤN ĐỀ
Qua nhiều năm nghiên cứu, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông lâm nghiệp Tây Nguyên đã lai tạo và chọn lọc ra được một số con lai F1 cà phê chè sinh trưởng tốt, năng suất cao và có khả năng kháng bệnh gỉ sắt cao (Trần Anh Hùng, 2007). Điều cần thiết là phải nhanh chóng nhân giống với số lượng lớn các con lai này cung cấp cho sản xuất, tuy nhiên quá trình nhân giống bằng phương pháp ghép chồi và sản xuất hạt lai còn gặp nhiều khó khăn. Vì vậy cần nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho cây cà phê chè lai để đạt được mục tiêu này.
Năm 2003-2005 Viện đã nghiên cứu kỹ thuật nhân in vitro đối với một số con lai cà phê chè và đưa ra quy phạm nhân giống in vitro cho 3 con lai: TN2, TN3, TN4. Bắt đầu từ lá, sau 14 tháng cây cà phê chè in vitro có thể đem ra trồng ngoài đồng và cây sinh trưởng tốt như những cây trồng bằng hạt khác. Tuy nhiên quy phạm này chưa được quan tâm ứng dụng vào sản xuất, bên cạnh đó quy phạm vẫn còn một số hạn chế như: chưa thử nghiệm nhiều môi trường phát sinh phôi, tốn khá nhiều thời gian cho cây con tái sinh trong môi trường thạch ở điều kiện phòng thí nghiệm … Để hoàn thiện qui trình, nghiên cứu này nhằm tiếp tục thử nghiệm một số môi trường phát sinh phôi soma khác nhằm làm tăng khả năng phát sinh phôi trên một mẫu lá, thực hiện một số thí nghiệm đưa cây con ra khỏi môi trường thạch huấn luyện sớm hơn, giảm được tiêu hao năng lượng điện trong phòng thí nghiệm và chi phí vật tư cũng như công thực hiện cấy chuyền.
- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu: Là hai con lai thế hệ F1 cà phê chè : TN2 và TN4, có năng suất cao, sinh trưởng tốt và kháng rất cao với bệnh gỉ sắt (Viện Khoa học kỹ thuật Nông lâm NghiệpTây Nguyên lai tạo năm 1993 từ Catimor x Thực liệu giống cà phê chè có nguồn gốc từ Ethiopia).
TN2: Catimor x KH4
TN4: Catimor x KH33
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Vào mẫu, tạo phôi soma: Hái lá bánh tẻ, rửa sạch, khử trùng mẫu bằng thuốc nấm và Hypochlorite Calcium 10 – 15 % trong 15 – 20 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng. Sau đó cắt lá thành mẫu nhỏ (khoảng 1cm2). Cấy mẫu lên môi trường thạch phát sinh phôi soma và phôi soma phát triển thành phôi dạng thủy lôi. Điều kiện nuôi cấy: cường độ ánh sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ngày, nhiệt độ 25 ± 20C.
– Thăm dò môi trường tạo phôi soma trực tiếp:
Thí nghiệm gồm 6 công thức: Môi trường Yasuda et al, 1985, có bổ sung BA (1,5 mg/l), môi trường Pierson et al, 1983, có thay đổi IBA (3 mg/l); 2,4D (2 mg/l) so sánh với môi trường đối chứng theo Qui phạm 2005 MS + 1,5mg/l 2ip + 0,1mg/l BA.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Thời gian mẫu tạo phôi
+ Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%)
Tỷ lệ mẫu tạo phôi được tính bằng % số mảnh lá phát sinh phôi trên tổng số mảnh lá đem nuôi cấy.
2.2.2. Tái sinh phôi dạng thủy lôi thành phôi có lá mầm:
Cấy chuyền phôi soma dạng thủy lôi sang môi trường thạch mới và nuôi dưỡng cho đến khi phôi phát triển thành phôi có lá mầm đầy đủ, có trục dưới lá mầm và rễ.
2.2.3. Huấn luyện cây in vitro trên giá thể bột xơ dừa: Phôi soma có lá mầm, tùy theo sự phát triển được cấy vào các khay chứa giá thể bột xơ dừa có nắp đậy trong suốt.
– Thí nghiệm 1:Huấn luyện sơ bộ. Thí nghiệm gồm 4 công thức:
CT1: Phôi có lá mầm nhỏ, kích thước < 2mm, không rễ.
CT2: Phôi có lá mầm phát triển, kích thước 2- 5 mm, có rễ.
CT3: Phôi có lá mầm phát triển , kích thước > 5mm, có rễ.
CT4: Cây con có một cặp lá thật, có rễ.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỷ lệ sống (%) sau 1, 2, 3, 4 tháng.
+ Sinh trưởng của cây trong xơ dừa sau 2, 4, 5 tháng.
– Thí nghiệm 2: Trồng cây con có một cặp lá thật vào bầu đất ẩm: Cây con có ít nhất một cặp lá thật được trồng vào bầu đất ẩm, chăm sóc bình thường như đối với cây thực sinh.
Thí nghiệm gồm 3 công thức:
CT1: Cây con có 1 cặp lá thật.
CT2: Cây con có 2 cặp lá thật.
CT3: Cây con có 3 cặp lá thật.
Chỉ tiêu theo dõi:
+ Tỉ lệ cây sống sau 1, 2, 3, 4, 5 tháng.
+ Sinh trưởng của cây trong vườn ươm sau 2, 4, 6 tháng: số lá phát sinh, chiều cao cây (cm).
2.2.4. Phát triển cây con trong vườn ươm: Cây con mang hai cặp lá thật được ra ngôi trong bầu đất PE, chế độ chăm sóc giống như đối với cây con trồng bằng hạt.
- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo phôi soma từ mảnh lá: Sau 4-6 tháng vào mẫu, có sự khác biệt có ý nghĩa về tỉ lệ mẫu phát sinh phôi trực tiếp trên các môi trường thử nghiệm.
Bảng 1. Tỉ lệ mẫu phát sinh phôi trực tiếp và số phôi/1cm2 lá trên các môi trường thử nghiệm (sau 4-6 tháng vào mẫu)
|
Chỉ tiêu |
Con lai TN2 |
Con lai TN4 |
||
|
Môi trường |
Số phôi/ 1cm2 lá |
Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%) |
Số phôi/ 1cm2 lá |
Tỉ lệ mẫu tạo phôi (%) |
|
1. Yasuda, 1985 |
0 c |
0 c |
0 |
0 |
|
2. Yasuda cải tiến |
0 c |
0 c |
0 |
0 |
|
3. Pierson, 1983 |
0 c |
0 c |
0 |
0 |
|
4. Pierson cải tiến 1 |
18 b |
37,3 b |
4 |
2,2 |
|
5. Pierson cải tiến 2 |
21 b |
22,7 b |
4 |
1,3 |
|
6. Đối chứng |
90 a |
80,0 a |
80 |
85,6 |
Đối với con lai cà phê chè TN2, trên 3 môi trường Yasuda (1985), Yasuda cải tiến và Pierson (1983) không có mẫu phản ứng tạo phôi. Trên môi trường Pierson cải tiến 1 và Pierson cải tiến 2, con lai TN2 có tỉ lệ mẫu tạo phôi trực tiếp tương ứng là 37,3 % và 22,7 %, và số phôi/ 1cm2 lá tương ứng là 18 và 21 phôi, tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Trên môi trường đối chứng, TN2 có tỉ lệ mẫu tạo phôi là cao nhất: 80%, số phôi bình quân/1cm2 lá: 90 phôi.
Đối với con lai cà phê chè TN4, tốt nhất là trên môi trường đối chứng, tỉ lệ mẫu tạo phôi: 85,6%, số phôi bình quân/1cm2 lá: 80 phôi. Còn trên các môi trường thử nghiệm khác, tỉ lệ mẫu phát sinh phôi là không đáng kể (biến động từ 0-2,2%), cũng như số phôi/1cm2 lá là không đáng kể (biến động từ 0 – 4 phôi).
Từ kết quả trên cho thấy tùy vào các kiểu gen khác nhau sẽ có phản ứng tạo phôi khác nhau. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Andrés M. Gatica và cộng tác viên (2008) khi nghiên cứu phát sinh phôi soma trực tiếp trên cà phê chè C. arabica L. cvs Caturra và Catuai. Đối với 2 kiểu gen này, khi sử dụng môi trường thạch Yasuda et al (1985), tuy có phát sinh phôi nhưng kết quả tạo phôi tương đối thấp, số lượng phôi đạt cao nhất trên mẫu 0,5 cm2 lá Caturra là 3,2 ± 0,2 và trên Catuai là 6,0 ± 0,4. Vì thế trong thí nghiệm này, đối với hai con lai cà phê chè TN2 và TN4, môi trường đối chứng MS có bổ sung 1,5mg/l 2ip + 0,1mg/l BA cho tỉ lệ và số phôi phát sinh trực tiếp cao nhất.
3.2. Tái sinh phôi dạng thủy lôi thành phôi có lá mầm
Cấy chuyền phôi soma dạng thủy lôi sang môi trường thạch và nuôi dưỡng từ 1 – 3 tháng cho đến khi phôi phát triển ở các dạng khác nhau: phôi có lá mầm nhỏ, trục dưới lá mầm có kích thước bé, không rễ hoặc có rễ; phôi có lá mầm phát triển to, có rễ và cây con có một cặp lá thật, có rễ.
Hình 3: Phôi dạng thủy lôi phát triển thành phôi có lá mầm
3.3. Huấn luyện cây in vitro trên giá thể bột xơ dừa
Sau 1 tháng trên giá thể bột xơ dừa, những phôi có lá mầm nhỏ, kích thước < 2mm, không rễ và những phôi có lá mầm phát triển, kích thước 2 -5 mm và có rễ (CT1 và CT2), cho tỷ lệ sống thấp (0 – 10%). Những phôi có lá mầm phát triển, kích thước > 5mm, có rễ, sau 3 – 4 tháng huấn luyện tỷ lệ sống đạt 55 – 60 %. Còn đối với cây con có một cặp lá thật (CT4), tỷ lệ sống đạt 70%. Như vậy, cần phải nuôi dưỡng phôi trong môi trường thạch để phôi phát triển thành cây con có ít nhất một cặp lá thật, có rễ mới đưa ra huấn luyện trên giá thể bột xơ dừa.
Trong thời gian huấn luyện, sinh trưởng của phôi trong giá thể xơ dừa được đánh giá bằng số lượng phôi đã phát triển đạt tới giai đoạn cây con có ít nhất một cặp lá thật đối với CT3 và số lượng cây con có 2 đến 3 cặp lá thật đối với CT4.
Bảng 2. Số lượng phôi phát triển thành cây con có ít nhất một cặp lá thật trong thời gian huấn luyện trên giá thể bột xơ dừa
|
CT |
|
Sau 1 tháng |
Sau 2 tháng |
Sau 3 tháng |
Sau 4 tháng |
||||
|
|
|
Cây con |
TL (%) |
Cây con |
TL (%) |
Cây con |
TL (%) |
Cây con |
TL (%) |
|
1 |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
2 |
|
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
3 |
|
0 |
0 |
14 |
21,2 |
20 |
30,3 |
24 |
36,4 |
|
4 |
a |
4 |
4,7 |
43 |
51,2 |
54 |
64,3 |
59 |
70,2 |
|
|
b |
0 |
0 |
3 |
3,6 |
17 |
20,2 |
18 |
21,4 |
Ghi chú: CT1: Phôi có lá mầm nhỏ, kích thước < 2mm, không rễ.
CT2: Phôi có lá mầm phát triển, kích thước 2- 5 mm, có rễ.
CT3: Phôi có lá mầm phát triển , kích thước > 5mm, có rễ.
CT4: Cây con có một cặp lá thật, có rễ.
a: Cây con có ít nhất hai cặp lá thật.
b: Cây con có ba cặp lá thật.
Kết quả ở bảng 2 cho thấy, ở CT2 tuy có một tỉ lệ nhỏ phôi sống nhưng trên bột xơ dừa phôi không phát triển, sau 4 tháng phôi vẫn tồn tại nhưng không có lá thật. Ở CT3, sau 3-4 tháng, tỉ lệ cây con có ít nhất một cặp lá thật (trong số các cây còn sống) từ 30,3 – 36,4%. Còn ở CT4, rất nhiều cây con phát triển thêm một cặp lá thật, sau 2 tháng có 51,2% cây con có 2 cặp lá thật, sinh trưởng khỏe mạnh, rễ phát triển tốt có thể cấy vào bầu đất chăm sóc trong vườn ươm. Theo dõi tiếp đến sau 3-4 tháng, tỉ lệ cây con có hai cặp lá thật tăng lên từ 64,3 -70,2%, trong số đó có 20,2 – 21,4% cây có ba cặp lá thật, sinh trưởng khỏe, rễ phát triển tốt .
3.4. Phát triển cây con trong giai đoạn vườn ươm
Cây con có ít nhất một cặp lá thật được lấy ra khỏi giá thể bột xơ dừa và cấy vào bầu đất ẩm trong vườn ươm.
Bảng 3. Tỉ lệ sống của cây con có ít nhất một cặp lá thật trong bầu đất (%)
|
CT |
Sau 1 tháng |
Sau 2 tháng |
Sau 3 tháng |
Sau 4 tháng |
||||
|
TN2 |
TN4 |
TN2 |
TN4 |
TN2 |
TN4 |
TN2 |
TN4 |
|
|
1 |
70 |
73,3 |
60 |
56,7 |
53,3 |
50 |
53,3 |
50 |
|
2 |
90 |
93,3 |
86,7 |
90,0 |
83,3 |
86,7 |
83,3 |
86,7 |
|
3 |
100 |
100 |
96,7 |
93,3 |
93,3 |
90 |
93,3 |
90 |
Ghi chú: CT1: Cây con có một cặp lá thật.
CT2: Cây con có hai cặp lá thật.
CT3: Cây con có ba cặp lá thật.
Sau 1 tháng trồng, tỉ lệ sống của cây con TN2 và TN4 ở CT1 dao động từ 70 – 73%, sau 2 tháng tỉ lệ này giảm xuống, còn từ 56,7 – 60%, sau 3 – 4 tháng tỉ lệ sống không thay đổi tuy có tiếp tục giảm so với sau 2 tháng, chỉ còn từ 50,0 – 53,3%. Ở CT2, cây con TN2 và TN4 có 2 cặp lá thật có tỉ lệ sống sau 1 tháng: 90,0 – 93,3%, sau 2 tháng tỉ lệ này là 86,7 – 90 % và sau 3- 4 tháng, tỉ lệ sống từ 83,3 – 86,7 %. Riêng đối với CT3, cây con TN2 và TN4 có 3 cặp lá thật sau 1 tháng trồng vào bầu đất có tỉ lệ sống 100% , sau 2 tháng tỉ lệ này giảm không đáng kể, còn từ 93,3 – 96,7 % và sau 3- 4 tháng, tỉ lệ sống ổn định, khá cao, từ 90,0 – 93,3 %. Tuy nhiên để có được số lượng lớn cây có 3 cặp lá thật ra ngôi trong bầu đất phải cần thời gian huấn luyện trong giá thể xơ dừa dài hơn.Vì vậy, từ kết quả của bảng 1 & 2 cho thấy chỉ cần cây con có hai cặp lá thật là có thể cấy vào bầu đất trong giai đoạn vườn ươm, cho tỉ lệ cây sống ổn định sau 3 tháng là > 83,3%.
Bảng 4. Sinh trưởng của cây con sau 6 tháng trong giai đoạn vườn ươm
|
Công thức |
TN2 |
TN4 |
||
|
|
Cao (cm) |
Số cặp lá |
Cao (cm) |
Số cặp lá |
|
1. Cây có 1 cặp lá thật |
17,5 c |
4,0 c |
18 ,0 c |
4,0 c |
|
2. Cây có 2 cặp lá thật |
23,0 b |
7,0 b |
22,5 b |
7,0 b |
|
3. Cây có 3 cặp lá thật |
26,0 a |
8,0 a |
25,0 a |
8,0 a |
Sau 6 tháng, sinh trưởng của cây con TN2 và TN4 ở 3 công thức thí nghiệm khác nhau có ý nghĩa thống kê, trong đó cây ở CT3 sinh trưởng tốt nhất (cây cao 25,0 -26,0 cm, có bình quân 8 cặp lá), tuy vậy cây con ở CT2 cũng phát triển tốt (cây cao 22,5 – 23,0 cm, có bình quân 7 cặp lá), thua kém cây ở CT3 là do xuất phát ban đầu khi cấy vào bầu đất cây bé hơn và có số cặp lá thật ít hơn. Theo tiêu chuẩn xuất vườn, cây cà phê con trong vườn ươm cao từ 20 -30 cm và có 5 – 6 cặp lá mới là có thể đem ra trồng ngoài đồng.
– Trồng cây con ra ngoài đồng ruộng
Chọn những cây sinh trưởng tốt, cao > 23 cm, mang ít nhất 5 – 6 cặp lá đưa trồng ra ngoài đồng ruộng.
Hình 6: Tiêu chuẩn cây con xuất vườn
Sau 4 tháng trồng ngoài đồng, cây cà phê chè in vitro sinh trưởng tốt, trung bình chiều cao của con lai TN2 là 33,5 cm, cây mang 2,9 cặp cành, đường kính gốc là 0,73 mm; Chiều cao trung bình của TN4 là 32,8 cm, cây mang 2,6 cặp cành, đường kính gốc là 0,84 mm.
Sau 12 tháng trồng ngoài đồng, chiều cao trung bình của TN2 là 89,6 cm, cây mang 11 cặp cành, đường kính gốc trung bình là 1,89 mm; Chiều cao trung bình của TN4 là 101,9 cm, cây mang 13 cặp cành, đường kính gốc trung bình là 2,01 mm.
- KẾT LUẬN
4.1. Kết luận
– Sử dụng môi trường MS bổ sung 2 ip (1,5mg/l) để gây tạo phôi soma cho 2 con lai cà phê chè TN2 và TN4, tỷ lệ mẫu tạo phôi đạt từ 80 – 85,6% và 80 – 90 phôi/1 cm2 mẫu lá.
– Cây con đã tái sinh trên môi trường thạch phát triển tốt, có một cặp lá thật và có rễ, sau thời gian huấn luyện sơ bộ trên giá thể bột xơ dừa 3-4 tháng , tỉ lệ sống đạt 70% và phát triển thêm từ 1- 2 cặp lá.
– Cây con có hai cặp lá được ra ngôi trong bầu đất ở giai đoạn vườn ươm, đạt tỉ lệ cây sống ổn định > 83,3% sau 3 tháng; sau 6 tháng cây cao 22,5 – 23 cm, có 7 cặp lá thật, đạt tiêu chuẩn đem trồng ngoài đồng.
– Cây in vitro trồng ra ngoài đồng bước đầu sinh trưởng và phát triển tốt.
4.2. Đề nghị
– Ứng dụng kết quả trên để xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cho hai con lai cà phê chè TN2, TN4.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
- Trần Anh Hùng, 2007– Lai tạo, chọn giống cà phê chè năng suất cao, chất lượng tốt và có khả năng kháng bệnh gỉ sắt. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, ISSN 0866-7020, số 107- Tháng 5/2007.
- Adrés M. Gatica, Griselda Arrieta, Ana. M. Espinoza, 2008 – Direct somatic embryogenesis in Coffea arabica cvs. Caturra and Catuaí: Effect of Triacontanol, light condition and medium consistency. Agronomia Costarricense 32(1): 139-147. ISSN: 0377-9424.
- Pierson E.S., Van Lammeren A.A.M., Schel J.H.N., Staritsky G., 1983– In vitro development of embryoids from punched leaf dishes of Coffea canephora. Protoplasma. 115: 208-216.
- Yasuda T.; Fufjii Y and Yamaguchi T. , 1985– Embryogenic callus induction from Coffea arabica leaf explant by benziladenine. Plant and Cell Physiology, 26, no. 3, p. 595-597.
(Kết quả nghiên cứu khoa học & Công nghệ 2006 – 2010 – Viện Khoa học kỹ thuật Nông lâm nghiệp Tây Nguyên)